Blood Advanced Direct PCR Kit是一款可直接對(duì)全血樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增而無需進(jìn)行DNA純化或樣本預(yù)處理的試劑盒，兼容含EDTA、肝素、檸檬酸鹽等常規(guī)抗凝劑的新鮮血液、冷藏（凍）血液及Whatman903^®和FTA^®商用干血漬。試劑盒中含有經(jīng)過經(jīng)基因工程改造的DNA Polymerase組合，具有保真性高、對(duì)PCR抑制劑耐受性強(qiáng)的特點(diǎn)，2× Hieff^® Blood Advanced PCR Buffer中添加強(qiáng)力延伸因子、擴(kuò)增增強(qiáng)因子以及優(yōu)化的緩沖體系，能夠在快速延伸條件下高效擴(kuò)增8 kb的基因組片段，對(duì)于2 kb以下的片段，設(shè)置3-5 sec/kb延伸時(shí)間即可完成擴(kuò)增，從而大幅縮短血液樣本的鑒定及檢測(cè)時(shí)間。

       Hieff^® Advanced High-Fidelity DNA Polymerase Mix的擴(kuò)增產(chǎn)物的3’端為平末端，適用于一步法快速克隆及TOPO克隆試劑盒（Yeasen CAT# 10907/10908/10909/10910/10911/10912/10922）。
  試劑盒中提供的引物預(yù)混液Positive control primer mix (10 μM each)能夠從哺乳動(dòng)物和大多數(shù)脊椎動(dòng)物的sox21基因上游保守序列中擴(kuò)增出長(zhǎng)度237 bp的片段，可作為陽性對(duì)照使用。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方式

干冰運(yùn)輸。-20℃保存，有效期1年。

適用范圍

不同類型的全血樣本直接PCR反應(yīng)。

注意事項(xiàng)

1. 推薦血液模板使用量為反應(yīng)總體積的10%，即50 μL反應(yīng)體系中加入5 μL全血作為模板，注意避免吸取血液凝塊。
2. 延伸時(shí)間10 sec/kb可擴(kuò)增8 kb以下大部分目的片段，3-5 sec/kb即可擴(kuò)增大部分2 kb以下片段。若擴(kuò)增效率較低，可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間至30 sec/kb。
3. PCR反應(yīng)結(jié)束后，推薦將反應(yīng)產(chǎn)物于4000 rpm (1000× g) 離心1-3 min以沉淀血細(xì)胞碎片，取上清進(jìn)行下游分析。
4. 本產(chǎn)品不可直接用于醫(yī)療診斷。
5. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

PCR反應(yīng)體系^a

^a 使用前請(qǐng)充分混勻各組分。

^b 推薦每條引物的使用終濃度為0.4 μM，過高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

^c 最佳全血模板濃度范圍為0.5%-20%，推薦使用量為10%作為初始嘗試條件，即50 μL反應(yīng)體系中加入5 μL全血作為模板，注意避免吸取血液凝塊。對(duì)于貯存在Whatman^®濾紙卡上的干血漬，則可取約1 mm²帶血漬的圓紙片，無需進(jìn)行預(yù)處理，直接放入PCR反應(yīng)液中即可進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)條件

^a 退火溫度為通用Tm值或低于引物Tm值1-2℃。如果擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較差，可以建立退火溫度梯度以尋找最佳退火條件。

^b 延伸時(shí)間10 sec/kb可擴(kuò)增8 kb以下大部分目的片段，3-5 sec/kb即可擴(kuò)增大部分2 kb以下片段。若擴(kuò)增效率較低，可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間至20-30 sec/kb，不應(yīng)超過60 sec/kb。

PCR產(chǎn)物分析
PCR反應(yīng)結(jié)束后，推薦將反應(yīng)產(chǎn)物于4000 rpm (1000× g) 離心1-3 min以沉淀血細(xì)胞碎片，取上清進(jìn)行下游分析。該步驟可消除全血中多種殘留成分對(duì)電泳檢測(cè)的干擾，對(duì)使用高濃度血液作為模板的PCR產(chǎn)物尤為必要。通常，5 μL/50 μL (10%)反應(yīng)產(chǎn)物可取30-35 μL上清，3 μL/50 μL (5%)反應(yīng)產(chǎn)物可取40-45 μL上清。若需對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行其它分析，例如酶切等，應(yīng)將產(chǎn)物稀釋2-4倍以降低反應(yīng)中的鹽及其它抑制劑對(duì)反應(yīng)的干擾。

對(duì)照反應(yīng)
試劑盒內(nèi)提供引物預(yù)混液Positive Control Primer Mix (10 μM each) 用于陽性對(duì)照反應(yīng)。可從哺乳動(dòng)物及其他許多脊椎動(dòng)物的基因組sox 21基因上游序列中擴(kuò)增出237 bp的片段，該擴(kuò)增區(qū)是一段高度保守的非編碼區(qū)。
Primer F: 5'- AGCCCTTGGGGASTTGAATTGCTG -3'   
Primer R: 5'- GCACTCCAGAGGACAGCRGTGTCAATA -3'

常見問題與解決方案

HB220617